没有薄弱环节：基于w&m的协作促进了对呼吸神经控制的理解
Patch-Seq是“贴片钳，其次是下一代测序”的缩写。这是一个合作的过程，只在几个佳博体育进行过。克里斯托弗·德尔·内格罗表示，这是有原因的。
“你必须有一个在各个方面都非常熟练的团队，因为如果你有一个薄弱环节——一个薄弱环节！——一切都失败了，”他说。
德尔·内格罗是威廉玛丽大学应用科学系的教授。他是一个跨学科团队的成员，该团队成功地利用Patch-Seq技术梳理了两组神经元的生理活动，这两组神经元在呼吸的产生中起着重要作用。
成功的Patch-Seq工作使我们对呼吸的神经控制有了更详细的了解。这一发现对睡眠呼吸暂停和其他与神经有关的呼吸系统疾病具有重要意义。
该团队由Del Negro佳博体育的研究生Prajkta Kallurkar领导，她于2021年获得博士学位。来自应用科学系的其他团队成员包括资深科学家蒂娜·皮卡多（Tina Picardo）和教授格雷格·康拉德·史密斯（Greg Conradi Smith）。该团队的成员包括日本东京智经大学医学院的生物学教授Margaret Saha和Yae杉村。
Kallurkar解释说，Del Negro佳博体育研究的是呼吸的神经基础。呼吸是由脑干中一个小得惊人的区域控制的，这个区域被称为pre-Bötzinger复合体。虽然pre-Bötzinger复合体很小，但里面充满了神经元，佳博体育想要确定负责产生呼吸节奏和运动模式的神经元的类别。
她说，他们的调查需要一系列协调一致的行动，而不是单一的技术。Patch-Seq首先记录pre-Bötzinger复合体目标区域内神经元的电生理特性，该复合体负责吸气和呼吸。杉村从日本飞过来，训练Kallurkar如何成功提取神经元，她帮助团队在不到一个月的时间内建立了Patch-Seq的记录和提取过程。
“一旦我们记录了电生理特性，我们就会提取所有的细胞内容物，然后我们进行下游RNA测序，”Kallurkar说。
电生理特性的测量，一种被称为“全细胞贴片记录”的技术，以及细胞提取都是用机器人引导的移液管进行的，这在处理小到单个神经元的目标时是必要的。研究小组将样本送去测序，但首先细胞内容物——从神经元中辛苦提取的RNA——由皮卡多逆转录成互补的DNA。
“我们实际上是针对样本的RNA，”她说。“所以，我采用了一些分子生物学技术来生成互补DNA，然后用它建立一个文库。
这个过程听起来直截了当，甚至很简单，但Kallurkar和Saha指出了Picardo在项目中所面临的挑战，这是一个被称为逆转录和图书馆建设的过程。许多挑战源于极少量的起始材料。
Kallurkar说：“Tina所做的是将不到一picogram的起始mRNA扩增成一个高质量的cDNA文库。”
皮卡多承认，这样一个涉及如此少量材料的艰苦过程带来了很高的样品失败率：在大约150个样品中，有18个成功扩增。
“这非常困难，”萨哈说。“蒂娜处理的材料太少了——眨眼的时候RNA就会降解！在进行测序之前，她自己负责所有的质量控制。所以这是非常困难的，也是一个令人难以置信的成就。”
Patch-Seq系列的下一个步骤是测序。Picardo处理过的样本被送到外部佳博体育，该佳博体育“读取”每个细胞cDNA文库中的核苷酸，然后将读取到的核苷酸组装成文本文件，然后发送回W&M团队。
数据科学二人组萨哈和康拉德史密斯在整个研究过程中帮助指导了团队。他们在处理从测序佳博体育返回的数据方面发挥了更重要的作用，揭示了哪些基因在序列中有代表，哪些基因有差异表达。
Kallurkar说，数据科学团队将注意力集中在两个目标pre-Bötzinger神经元类别的相关基因上，它们被标记为1型和2型。由于他们的动物模型是小鼠，数据科学工作从小鼠参考基因组开始。
数据分析师使用绘图软件将样本图中的特定核苷酸序列与已知的小鼠基因进行比较。这是一个“大数据”问题，使用基因组数据科学和W&M超级计算机集群来解决。Kallurkar说，小鼠参考基因组包含大约55,000个基因，其中约33,000个基因在该小组的样本中表达。
Kallurkar解释说：“从这个角度来看，我们在单个细胞中有超过33,000个基因，我们有17个细胞。”“所以我们的矩阵是33000 × 17。”
她说，在这个基质中，研究人员正在寻找属于两组具有不同电学特性的神经元的基因。这些样本包含一批7个神经元和一批9个神经元。
“所以，现在，我们想知道的是：在这33000个神经元中，有多少神经元在这两组神经元之间表达不同？”Kallurkar说。她解释说，如果一个特定的基因在一种细胞中高度表达，而在另一种细胞中没有表达，这表明该基因对这种特定类型的细胞很重要，“我们应该追踪这种特定的基因，以瞄准这一群体。”
Conradi Smith评论道：“数据科学方面的工作非常繁重。神经转录组研究是非常优秀的大数据。Prajkta的成功需要熟练使用Python脚本，熟悉几个复杂的生物信息学软件包，以及对统计理论的深刻理解。”
Patch-Seq技术是大约在五年前开发的，德尔内格罗说，只有25项研究使用了这项技术。
他补充说：“在这25项研究中，只有另外两项研究是在具有已知行为功能的人群中进行的。”这些是胰岛细胞和视网膜细胞。每个人都知道这群神经元产生呼吸节奏并表达呼吸运动模式的初始阶段。我认为这是这项工作的另一个重要方面。”
合作者在冷泉港佳博体育的bioRxiv服务器上有一篇预印本论文。德尔内格罗说，这项工作是如此新颖，如此跨学科，以至于为它找到合适的同行评议期刊是一项挑战。
“Patch-Seq仍然是一种新技术，”他说。“我们正在四处寻找，试图找到合适的地点。我认为我们只是还没有找到合适的受众。”
德尔内格罗补充说，这项研究的重点——1型和2型神经元——是一个更大的类别Dbx1的子集——是皮卡多在2010年发现的，也是她博士论文的主题。
德尔内格罗说：“这是一项长达十年的努力的后续研究，旨在了解这种具有已知行为功能的单一种群。”“这是一条贯穿几十年的线索。”
